一般傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)流程為：

利用半理性的方式完成突變體基因的構(gòu)建后，將構(gòu)建的基因搭載至質(zhì)粒上，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)載體細(xì)胞內(nèi)。然后從涂布的平板上挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后可以得到表達(dá)突變體蛋白的細(xì)胞株。通過細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)，之后裂解相應(yīng)細(xì)胞，即可得到含有目的突變蛋白的混合液。在此之后就可以進(jìn)行突變蛋白的純化和測試操作。該方法操作復(fù)雜且流程較長，如果目的突變蛋白對宿主細(xì)胞有毒害作用的話，可能會導(dǎo)致表達(dá)失敗。

對于這種高通量篩選來說，無細(xì)胞蛋白表達(dá)顯然是一種更有效的選擇。無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，利用裂解的生物體的生物質(zhì)，如核糖體、轉(zhuǎn)錄翻譯酶等成分，再加入合適的能量氨基酸等支持體系，即可在體外借助加入的模板DNA，實現(xiàn)快速高效的蛋白表達(dá)。無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可以有效地簡化蛋白表達(dá)的操作，使其更易于匹配高通量的應(yīng)用場景。同時其快速表達(dá)的特點(diǎn)，可以縮短蛋白表達(dá)的時間，有效縮短項目周期。

我們選取了phi29DNA聚合酶的第221位和第350位氨基酸作為突變位點(diǎn)。先利用PCR的方式，將突變通過引物引入片段；再通過重疊PCR的方式整合突變片段。將整合好的目的基因片段和線性化的環(huán)狀片段通過seamless酶進(jìn)行連接，形成環(huán)化質(zhì)粒。

在此過程中，每次以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR之后，使用Dpn I 酶37℃消化1h以去除原始模板。

通過上述實驗，珀羅汀生物展示了一種運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，高通量篩選并驗證突變蛋白的方法。該方法在3天內(nèi)完成了近百種突變蛋白的構(gòu)建表達(dá)及活性驗證，顯著縮短了蛋白篩選的時間，減少了人工操作成本，提高了研發(fā)效率。

蛋白質(zhì)生物活性和穩(wěn)定性的不斷提升，對于蛋白類產(chǎn)品在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、造紙、紡織、生物能源、家庭護(hù)理等方面推廣應(yīng)用，有著舉足輕重的作用。運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，能夠更高效快速地完成蛋白質(zhì)改造與篩選，縮短酶制劑、蛋白藥物等各類蛋白產(chǎn)品的研發(fā)周期，降低研發(fā)成本，從而促進(jìn)新型重組蛋白、酶、抗體等蛋白產(chǎn)品的快速發(fā)展。

珀羅汀生物作為一家專業(yè)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)生物技術(shù)公司，將繼續(xù)利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)勢，開發(fā)更為廣泛的應(yīng)用場景。