蛋白質(zhì)設(shè)計的目標是創(chuàng)建具有特定功能的蛋白質(zhì)，目前，基于物理的方法雖然能夠提供詳細的結(jié)構(gòu)信息，但成功率相對較低。相比之下，基于機器學(xué)習(xí)的方法顯著提高了設(shè)計的成功率，但設(shè)計失敗的情況仍然普遍。而且，無論采用哪種方法，最終都需要通過實驗來驗證設(shè)計的蛋白質(zhì)是否具有預(yù)期的功能。當前主要的挑戰(zhàn)是從數(shù)十到數(shù)百個設(shè)計中篩選出那些具有預(yù)期功能的蛋白質(zhì)，并且要明確設(shè)計失敗的原因，包括表達和可溶性問題以及未能形成正確的結(jié)構(gòu)和功能的原因。因此，尋找一種高效、便捷的方法來篩選和驗證蛋白質(zhì)設(shè)計顯得尤為重要。

無細胞蛋白合成（CFPS）提供了一種更為簡單的方法來識別功能性設(shè)計，并能解釋設(shè)計為何未能如預(yù)期般表現(xiàn)。CFPS相比在傳統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的方法具有多個優(yōu)勢，如不受宿主細胞存活限制、可生產(chǎn)細胞毒性蛋白、反應(yīng)僅由目標DNA編程、條件易于調(diào)整、適合小體積篩選且成本低。此外，CFPS更便于生產(chǎn)制造和測試設(shè)計蛋白的功能，并探索設(shè)計失敗的原因，從而可以提供豐富的數(shù)據(jù)集以優(yōu)化后續(xù)設(shè)計等。

在蛋白質(zhì)設(shè)計中，篩選活性是關(guān)鍵步驟之一。CFPS作為一種高效且靈活的方法，在這一過程中發(fā)揮了重要作用，它可以快速評估蛋白質(zhì)的活性，同時還能幫助識別設(shè)計失敗的原因。此外，CFPS可以在微孔板或微流控設(shè)備中進行，反應(yīng)體積小，適合大規(guī)模篩選。例如，通過熒光或比色法可以直接檢測酶活性，而無需復(fù)雜的純化步驟。CFPS還可以用于高通量篩選，例如Rapp等人通過機器人自動化系統(tǒng)結(jié)合CFPS來探索蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和活性。這種方法不僅提高了篩選效率，還能夠在短時間內(nèi)排除無效的設(shè)計。從而快速篩選出功能性蛋白質(zhì)，還能為設(shè)計失敗提供寶貴的信息，從而指導(dǎo)后續(xù)的設(shè)計改進，例如，de los Santos等人通過CFPS篩選出具有特定DNA結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄抑制因子突變體，Rolf等人通過優(yōu)化反應(yīng)條件提高酶的可溶性產(chǎn)量?？傊?，CFPS是一種簡單、信息豐富且易于操作的技術(shù)，非常適合用于蛋白質(zhì)設(shè)計和驗證流程。

蛋白質(zhì)表面捕獲是評估蛋白質(zhì)功能的重要手段。通過將蛋白質(zhì)產(chǎn)品固定到固體表面上，可以將其與CFPS試劑分離，從而通過清洗表面實現(xiàn)這一目的。這使得可以在不同條件下測試蛋白質(zhì)活性，如pH值、溫度、緩沖液成分以及對不同底物的反應(yīng)性。并且可以測試每個突變體在多種條件下的表現(xiàn)。如，PISA（Protein In Situ Array）技術(shù)通過鎳涂層表面捕獲帶有His標簽的蛋白質(zhì)，實現(xiàn)高通量功能檢測。最近，Thornton將自組裝蛋白質(zhì)表面用于共價捕獲無細胞合成的蛋白質(zhì)。具體來說，可通過His標簽蛋白、生物素化的DNA、BslA-SpyTag 形成自組裝蛋白質(zhì)單層等策略來實現(xiàn)表面補獲。這些方法不僅能夠高效地捕獲蛋白質(zhì)，還能夠在不同的實驗條件下進行蛋白質(zhì)功能的測試，從而為蛋白質(zhì)設(shè)計和功能研究提供了強大的工具。